腺病毒載體是基因治療臨床試驗中常用的遞送工具，同時在腫瘤治療中，作為疫苗載體與溶瘤制劑也具備巨大應(yīng)用潛力。其優(yōu)勢在于可制備得到高滴度病毒，基因組易于改造，并且能夠在多種分裂與非分裂細胞中驅(qū)動高水平的轉(zhuǎn)基因表達。

盡管擁有上述優(yōu)良特性，但人群中普遍存在的預(yù)存免疫，限制了腺病毒載體的大規(guī)模應(yīng)用。絕大多數(shù)腺病毒載體基于5 型腺病毒（Ad5）構(gòu)建，該問題在 Ad5 上尤為突出。預(yù)存體液免疫會造成轉(zhuǎn)基因表達水平低下；用于疫苗接種時，還會使機體針對靶抗原的 CD8?T 細胞應(yīng)答減弱。因此，闡明抗 Ad5 抗體存在條件下，介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因表達抑制、激活免疫應(yīng)答的分子機制，將為克服預(yù)存免疫難題提供新的研究思路。

絕大多數(shù)抗 Ad5 中和抗體（NAbs）靶向病毒主要外殼蛋白六鄰體（hexon），更具體地說，是靶向其暴露于溶劑的高變區(qū)（HVR）。而 Ad5 依賴柯薩奇?腺病毒受體（CAR）的入胞過程，由纖突蛋白與五鄰體基底介導(dǎo)，六鄰體并不參與該過程。由此說明，這種中和效應(yīng)并非通過傳統(tǒng)的阻斷病毒入胞途徑實現(xiàn)。

在靈長類與嚙齒類動物體內(nèi)，Ad5 可被多種細胞攝取，包括庫普弗細胞與肝細胞。由于TRIM21幾乎在所有組織中廣泛表達，該分子可能在上述兩種細胞中均參與免疫應(yīng)答。初次給予 Ad5 載體時，單核?吞噬系統(tǒng)會在病毒感染肝實質(zhì)細胞之前將其清除。因此，本研究嘗試在Ad5感染前用荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑耗竭/清除巨噬細胞，以此區(qū)分巨噬細胞內(nèi) TRIM21 介導(dǎo)的中和作用與肝細胞內(nèi)的中和效應(yīng)。

為此，在注射 Ad5 之前，利用荷蘭Liposoma氯膦酸脂質(zhì)體ClodronateLiposomes耗竭庫普弗細胞，并通過 Adgre1、Clec4f 標志物驗證耗竭效果。經(jīng)氯膦酸處理的小鼠對脂多糖（LPS）的應(yīng)答水平下降，證實巨噬細胞功能被有效耗竭。PBS 脂質(zhì)體處理雖不會影響巨噬細胞數(shù)量，但會輕微減弱炎癥應(yīng)答，因此后續(xù)實驗僅采用 PBS 作為對照組。

氯膦酸鹽脂質(zhì)體ClodronateLiposomes清除肝臟巨噬細胞qPCR檢測方案。

(A) 分別給予 PBS、PBS 脂質(zhì)體、氯膦酸脂質(zhì)體處理 48?h 后，小鼠肝臟中庫普弗細胞標志物 Clec4f 與泛巨噬細胞標志物 Adgre1 的表達水平。

(B) 經(jīng) PBS、PBS 脂質(zhì)體或氯膦酸脂質(zhì)體處理的小鼠，注射 LPS?6?h 后肝臟細胞因子的誘導(dǎo)情況。每組小鼠樣本量 n?=?3。

Ad5 感染前 48 小時進行巨噬細胞耗竭處理，可提升轉(zhuǎn)基因表達水平（圖 1G），這與巨噬細胞能夠清除病毒、限制轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的已知功能相吻合。該效應(yīng)在病毒劑量為 10?的低劑量組中最為顯著，氯膦酸處理小鼠的轉(zhuǎn)基因表達提升 8 倍。該結(jié)果提示巨噬細胞優(yōu)先攝取病毒；但高病毒劑量下巨噬細胞會達到攝取飽和，從而使肝細胞發(fā)生有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。該發(fā)現(xiàn)與既往文獻報道的小鼠 Ad5 劑量?反應(yīng)非線性關(guān)系一致：先給藥會使庫普弗細胞飽和，第二次給藥時更多病毒顆粒便可有效感染肝細胞（28）。

在給予野生型 rh9C12 抗體的條件下對小鼠注射 Ad5?Luc，PBS 組與氯膦酸處理組小鼠的轉(zhuǎn)基因表達均顯著下降（圖 1H）。兩種處理條件下該抑制效應(yīng)均高度依賴 TRIM21，說明 TRIM21 能夠直接在肝細胞中高效阻斷基因遞送，該過程不依賴巨噬細胞的中和作用。

圖1.抗 Ad5 抗體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達下調(diào)依賴 TRIM21。(A) 感染后不同時間點的病毒拷貝數(shù)。(B) 人 IgG1 結(jié)構(gòu)模式圖。參與結(jié)合 Fcγ 受體的關(guān)鍵殘基標為紅色（L234/L235）；TRIM21 與 FcRn 結(jié)合位點標為藍色（H433 為淺藍，N434、H435 為深藍）。(C) 在野生型小鼠體內(nèi)，分別給予 2.5?μg 野生型 rh9C12 抗體、FcγR 結(jié)合缺陷突變體 LALA，檢測 Ad5?Luc 在肝臟中的相對感染水平。(D) 使用 1?μg 野生型 rh9C12 抗體、TRIM21 結(jié)合缺陷突變體 H433A，檢測 Ad5?Luc 在野生型與 T21?KO 小鼠肝臟（左）、脾臟（右）中的相對感染水平。(E) 使用 1:500 稀釋的抗 Ad5 免疫血清處理，感染 4?h 后的病毒拷貝數(shù)。(F) 使用不同稀釋比例的抗 Ad5 免疫血清，檢測 Ad5?Luc 在野生型與 T21?KO 小鼠肝臟中的相對感染水平。(G) 氯膦酸處理組與對照組小鼠中，以相對光單位（RLU）檢測得到的絕對感染水平。(H) 使用 1?μg 野生型 rh9C12 抗體、TRIM21 結(jié)合缺陷突變體 H433A，檢測氯膦酸處理組與對照組小鼠體內(nèi)的相對感染水平。誤差棒代表平均值 ± 標準誤（mean ± SEM）；每組小鼠樣本量 n?=?3?10。

論文信息：

論文題目：TRIM21 mediates antibody inhibition of adenovirus-based gene delivery and vaccination

期刊名稱：PNAS

時間期卷：115 (41) 10440-10445

Doi.org/10.1073/pnas.1806314115

產(chǎn)品信息：

貨號：CP-010-010

規(guī)格：10ml+10ml

品牌：Liposoma

產(chǎn)地：荷蘭

名稱：Clodronate Liposomes&Control Liposomes

辦事處：靶點科技

Clodronate Liposomes氯膦酸鹽脂質(zhì)體清除腺病毒遞送小鼠肝臟巨噬細胞。荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑ClodronateLiposomes見刊于PNAS：TRIM21介導(dǎo)抗體對基于腺病毒的基因遞送和疫苗接種的抑制作用。

Liposoma巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes氯膦酸二鈉脂質(zhì)體清除巨噬細胞的材料和方法：

In vivo macrophage depletion

Liver Macrophage Depletion.

巨噬細胞清除材料和方法文獻截圖：